Иммуночип для cеродиагностики сифилиса

Смердова М.А., Маркелов М.Л., Судьина А.Е., Шишова А.В, Гущин А.Е., Шипулин Г.А.

ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва

Цель: разработка тест-системы в формате иммуночипа для серологической диагностики сифилиса, не уступающей по по-казателям чувствительности и специфичности общепризнанным методам (ИФА, РПГА, иммунный блоттинг). Предполагается, что такой иммуночип повысит эффективность обследования пациентов, совместив одновременно скрининг и выявление спектра антител благодаря раздельной иммобилизации антигенов на слайде.

Материалы и методы: для иммобилизации на слайдах нами были получены 4 рекомбинантных иммуногенных белка Treponema pallidum (Tp 47, Tp 17, Tp 15, TmpA), экспрессированных в Escherichia coli и очищенных методами аффинной и ионообменной хроматографии. С целью приготовления иммуносорбента антигены были раздельно сорбированы на активированные слайды с помощью роботов для микропечати. Каждому антигену соответствовал индивидуальный спот (пятно). Принцип работы тест-сис-темы был построен на непрямом методе выявления специфических антител к возбудителю с помощью флуоресцентной детекции. На одном эррее (аналог лунки планшета, стрипа) в нашей тест-системе возможно одновременно детектировать антитела как IgG, так и IgM, используя смесь антивидовых коньюгатов человека, модифицированных TRITC или FITC соответственно. Результаты анализировали с помощью сканера SсanArray Express (Perkin Elmer) и прилагаемого программного обеспечения. Определяли абсолютные значения флуоресценции спотов. Для каждого антигена рассчитывали ОП крит = 2хК-, где К- значение флуоресценции отрицательного контрольного образца. Образец считали положительным, если значения сигналов флуорес-ценции по двум и более спотам превышали или были равны ОП крит. Образец считали неопределенным (сомнительным) при выявлении положительного сигнала флуоресценции для одного из спотов. Образец считали отрицательным, если значения сигнала флуоресценции для всех спотов были меньше значенияОП крит.

Для оценки чувствительности экспериментальной тест-системы в формате иммуночипа были исследованы 200 сывороток крови от больных сифилисом. Для анализа специфичности тест-системы была сформирована контрольная группа, включающая 100 сывороток от больных другими патогенными спирохетозными инфекциями (50 — от больных Лайм-боррелиозом, 50 — от больных лептоспирозом), а также 100 сывороток крови здоровых доноров.

На первом этапе в качестве методов сравнения нами были использованы следующие тесты: вариант иммуноферментного анализа с применением хемилюминесцентной детекции (тест-система «Syphilis TP», Abbott, Япония) и реакция пассивной ге-магглютинации (РПГА) с использованием набора «TPHA TESRS», «BIO-RAD», Франция. Сыворотки, для которых были получены дискордантные результаты, дополнительно характеризировали методом иммунного блоттинга с применением набора «INNO-LIA Siphilis Score» производства фирмы «Innogenetics», Бельгия.

Результаты: при анализе образцов сывороток крови, отнесенных к контрольной группе, была установлена 100%-ная специфичность тест-системы в формате иммуночипа. В ряду 200 положительных сывороток крови получены дискордантные результаты по 5 образцам, которые были охарактеризованы нами как сомнительные, т. к. в экспериментальной тест-системе показали положительный результат только по одному антигену Тр 17. Эти же сыворотки давали слабоположительные резуль-таты в тест-системах ИФА и РПГА. При анализе дискордантных образцов методом иммунного блоттинга на стрипах «INNO-LIA Siphilis Score» были также выявлены антитела только к Tp17, что сопоставимо с результатами, полученными в тест-системе в формате иммуночипа.

Выводы: разработана экспериментальная тест-система для дифференциальной серологической диагностики сифилиса в формате иммуночипа, которая продемонстрировала высокую чувствительность и специфичность.