Введение

Пемфигоид слизистой оболочки (ПСО) относится к аутоиммунным пузырным заболеваниям с субэпидермальным расположением пузырей с преимущественным поражением слизистой оболочки (1-4). ПСО вызвана аутоантителами против различных аутоантигенов в зоне базальной мембраны (ЗБМ), в том числе коллагена XVII типа (COL17, также называемый BP180) (5), BP230 (6), ламинин 332 (7–9), интегрин α6/β4 (10–12), и коллаген VII типа (COL7) (13, 14). Из них C-концевая часть COL17 и laminin 332 считаются основными аутоантигенами для ПСО. Аутоантитела против интегрина 6/β4 ассоциированы с возникновением очаговых поражений (15). Клинически наиболее распространенным местом поражения слизистой при ПСО является слизистая оболочка полости рта (80-90%). Также бывают вовлечены слизистая оболочка глаз (50%), кожа (20%), слизистая оболочка половых органов (15%), слизистая оболочка заднего прохода (10%) и глотки, пищевода и гортани (<10%) (16). В ротовой полости наиболее часто поражаются десны (70% случаев ПСО полости рта), за которой следуют слизистая оболочка щеки (60%), небо (27%) и язык и губы (13%) (17).

ПСО относительно трудно диагностировать клинически, по нескольким причинам, которые описаны в следующем разделе. Одна из причин заключается в том, что титр аутоантител при ПСО ниже, чем при буллезном пемфигоиде (БП) (18, 19), которая является наиболее распространенным аутоиммунным пузырным дерматозом (2). Таким образом, циркулирующие аутоантитела обнаруживаются при ПСО реже, чем при БП (17), что приводит к проблемам в диагностике ПСО.

Патогенез ПСО до настоящего времени изучен недостаточно. Что касается механизма образования пузырей при аутоиммунных пузырных дерматозах, то сообщалось о прямом ингибировании комплекса белок-белок аутоантителами при пузырчатке (20, 21) и/или Fc–опосредованной активации комплемента и клеток, участвующих в воспалении при пемфигоиде, а также при буллезном эпидермолизе (22, 23). Однако механизм образования пузырей на слизистой оболочке полости рта при пемфигоиде остается нераскрытым. Гистологически у пациентов с ПСО, как правило, наблюдается меньше признаков воспаления, чем у пациентов с БП (24). Это может указывать на различия в механизмах образования пузырей между ПСО и БП.

В данной статье рассматриваются диагностические рекомендации по совершенствованию клинической диагностики ПСО и описывается возможный патомеханизм формирования специфического для слизистой оболочки полости рта пузыря, при менее выраженных воспалительных явлениях.

Проблемы в диагностике ПСО

Для диагностики ПСО мы проводим несколько исследований, в том числе гистологический и иммунологический анализы. Гистологически разобщение связи между клетками в ЗБМ наблюдается в образцах из пораженной слизистой оболочки (25, 26). Однако гистопатологическое исследование проводится не всегда, особенно когда очаги поражения ограничиваются тканью глаз из-за нерешительности относительно выполнения биопсии конъюнктивы и опасений по поводу образования рубцов. Кроме того, при таком обследовании не всегда выявляются субэпидермальные пузыри из-за разрушения тканей (27). Иммунологически отложение аутоантител IgG и С3, а иногда и IgA-аутоантител, в ЗБМ может быть обнаружено методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) в образцах пораженной кожи или прилегающих участках (1 , 28). Для выявления циркулирующих аутоантител в ЗБМ обычно проводят непрямую иммунофлюоресценцию (НИФ) с участком непоражённой кожи человека в качестве субстрата, но аутоантитела выявляются только в 17-53% случаев ПСО (5, 17, 18, 29). По последним данным нашей клиники, в 22% (8/36) случаев аутоантитела при ПСО (IgG) выявляются НИФ при исследовании участка непоражённой кожи человека. 

Расщепление биоптата кожи 1 м-раствором NaCl с применением НИФ более чувствительно, чем НИФ. Окрашивание при ПСО сывороткой приводит к линейным отложениям IgG в 58-82% случаев ПСО на эпидермальной или дермальной стороне ЗБМ (17, 30, 31). Несмотря на то, что этот метод расщепления может быть полезным для дифференциации аутоантигенов, расположенных на эпидермальной стороне ЗБМ от тех, которые расположены на дермальной стороне ЗБМ, вызывая разделение на уровне lamina lucida, он не позволяет окончательно идентифицировать аутоантигены. Иммуноблоттинг с использованием эпидермальных или дермальных экстрактов и рекомбинантных антигенных полипептидов полезен для выявления специфических таргетных аутоантигенов, хотя эти методы обычно не используются в рутинных исследованиях. 

Фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISa) широко используются для выявления аутоантител, связывающих специфические аутоантигены (32, 33). Приблизительно 85-96% аутоантител при БП выявляются с помощью коммерчески доступных систем COL17-NC16A ELISA или хемилюминесцентного иммуноферментного анализа (ClEIA) (33-36). Тем не менее, антигены не которые нацелены коммерчески доступные системы ELISA/CLEIA, ограничены определенными доменами на белках ЗБМ, такими как COL17 (NC16A), BP230 (N/C-terminus) и COL7 (NC1/ NC2) (37). Из-за низкого титра и гетерогенности аутоантител при ПСО только 30-52% аутоантител типа COL17 могут быть распознаны с помощью COL17 NC16A ELISA/CLEIA (17, 38, 39). Из-за этих проблем определенная доля пациентов с ПСО не может быть диагностирована и пролечена.

Способы диагностики ПСО

Способ сохранения структуры биоптата при окрашивания гематоксилином и эозином (H&E)

Неадекватные методы биопсии и неправильное обращение с тканью могут легко привести к потере эпителия слизистой оболочки полости рта в образцах от пациентов с ПСО. Разрушение слизистой оболочки полости рта затрудняет постановку диагноза. Эндо и соавт. представлена методика биопсии "stab-and-roll" для сохранения эпителия десны при десквамативном гингивите (40). Этот метод предназначен для предотвращения отслаивания эпителия от образца биопсии путем уменьшения воздействия боковых сил во время процедуры. У 52 пациентов с десквамативным гингивитом эпителий сохранялся у 12 из 13 пациентов с ПСО, при использовании данной методики.

Тканевые иммуноглобулин и комплемент

В случаях, которые трудно диагностировать, ПИФ с использованием ткани пациента является ценным методом диагностики ПСО. Шиманович и соавт. показали, что многократные и повторные биопсии повышают чувствительность ПИФ (41). При первом обследовании у 69% (36/52) пациентов, которым была выполнена только 1 биопсия, результаты оказались положительными, в то время как у 85% (22/26) пациентов, которым были выполнены биопсии из более чем 1 участка, были положительными. В целом, 95% (74/78) показали положительные результаты ПИФ после повторных биопсий. Та же группа продемонстрировала, что иммуногистохимическое исследование C3d или C4d полезна при скрининге случаев подозрения на ПСО, когда имеется парафиновая ткань (42). Линейные отложения C3d или C4d были обнаружены у 53% (18/34) или 59% (20/34) пациентов соответственно. Мы также сообщили, что ПИФ-образцы, взятые из неповрежденной слизистой оболочки щеки с помощью пункционной биопсии, способствуют диагностике ПСО (27). В 7 случаях ПСО с преобладанием поражения десны при поражении полости рта во всех случаях были обнаружены тканевые антитела. Слизистая оболочка щеки легкодоступна, а пункционные биоптаты обеспечивают хорошее состояние структур ЗБМ.

Обнаружение аутоантител

Ламинин-332-тип ПСО

Goletz и соавт. установлен специфический НИФ-тест с использованием ламинин-332-экспрессирующих клеток HEK293 человека для выявления анти-ламинин 332 аутоантител (43). Используя мозаику BIOCHIP®, гетеротример ламинина-332 распознает 77% (72/93) анти-ламинин-332 ПСО. В ряде исследований были разработаны системы ELISA для выявления аутоантител к ламинину-332. Бернард и соавт. был представлен новый ELISA, который использует очищенный ламинин-332 из клеток SCC25 и выявляет аутоантитела у 20,1% пациентов с ПСО (44). Chiorean и соавт. показано, что результаты ELISA с использованием очищенного или рекомбинантного человеческого ламинина-332 тесно коррелируют с результатами иммуноблоттинга в 36 случаях ПСО (45).

COL17-тип ПСО

Али и соавт. показано, что обнаружение в слюне IgG- и IgA-антител против COL17-NC16A равны обнаружению таковых в сыворотке крови по диагностической ценности (39). 45% (29/64) образцов цельной слюны и 53% (33/64) образцов сыворотки крови были положительными на антитела IgG и/или IgA методом COL17-NC16A ELISA. Однако было обнаружено, что 50-70% аутоантител при ПСО в основном реагируют с C-концом COL17, а не с доменом COL17-NC16A (5, 6, 46). Иммуноанализы для обнаружения аутоантител против всего дополнительного домена COL17 должны быть разработаны. Schmidt и соавт. предложен ИФА, который использует клетки насекомых Sf21, экспрессирующие полноразмерный COL17 (47). Новый анализ выявил 84% (6/7) циркулирующих аутоантител в сыворотках при ПСО. Недавно Izumi и соавт. создана новая система ELISA с использованием полноразмерного человеческого рекомбинантного белка COL17 (full-length COL17 ELISA) (48). 

С помощью полноразмерного COL17 ELISA 9 из 12 случаев ПСО (75%) показали положительную реакцию, в то время как с обычным COL17-NC16A ELISA и BP230 ELISA, 4 из 12 сывороток (42%) и 3 из 12 сывороток (25%) показали положительную реакцию, соответственно. Мы сообщили еще об одной уникальной концепции, которая помогла бы преодолеть трудность обнаружения аутоантител при ПСО. РНИФ обычно выполняется с использованием нормальной кожи человека, хотя при ПСО в основном поражается слизистая оболочка, а не кожа. 

Мы провели тесты РНИФ с использованием непоражённой слизистой оболочки полости рта человека (18). В 20 случаях ПСО и 20 случаях БП чувствительность сравнивали методом РНИФ с использованием кожи и слизистой оболочки. 85% (17/20) сывороток при ПСО реагируют на слизистую оболочку, а 35% (7/20) - на кожу. Иммуноблоттинг с использованием нормальных эпидермальных кератиноцитов человека (кератиноцитов кожи) и нормальных лизатов кератиноцитов слизистой оболочки полости рта человека позволил выявить аутоантитела. Лизаты кератиноцитов кожи и слизистой оболочки реагировали на 180-кДа белок, соответствующий COL17 в 10% (2/20) и 55% (11/20) ПСО сыворотки, соответственно.

Субстраты слизистой (нормальная слизистая оболочка полости рта и нормальные кератиноциты слизистой оболочки полости рта) полезны для обнаружения аутоантител и идентификации аутоантигенов при ПСО. Однако получить биоптат слизистой оболочки полости рта сложнее, чем кожи. Чтобы решить эту проблему, мы попытались сохранить кератиноциты слизистой оболочки полости рта с помощью белков Е6/Е7 ВПЧ (49). Клеточные лизаты сохранённых кератиноцитов слизистой оболочки эффективно идентифицировали аутоантигены при ПСО в 60% (18/30) ПСО-сывороток.

При оценке чувствительности обнаружения COL17-NC16A-специфического IgG, Emtenani и соавт. сообщалось, что таковая непоражённой кожи человека была выше, чем у ткани пищевода обезьяны. В пищеводе обезьяны обнаруживалось только 17% (2/12) антител к COL17-NC16A, в то время как в коже обнаружилось 100% (12/12) антител (50). Вместе с низкой гомологией COL17-NC16A между пищеводом человека и обезьяны, эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия белка COL17 отличается анатомическим расположением, таким как кожа и слизистая оболочка. Использование подходящих образцов для РНИФ из конкретных участков может способствовать чувствительному обнаружению аутоантител при пемфигоиде.

Предлагаемые диагностические стратегии

Диагностические критерии для ПСО остаются неясными. Отсутствие общепризнанных диагностических критериев может привести к несвоевременной постановке диагноза или ошибочной постановке диагноза. Международный консенсус задокументировал, что клинические данные о преимущественном поражении слизистой оболочки и ПИФ, обнаруживающая тканевые IgG, IgA и/или C3, имеют важное значение для постановки диагноза (1). Этим критериям следовали несколько исследований (41, 44, 51). Мы также принципиально согласны с этими критериями и ввели их в наши исследования. 

Однако, при изолированном поражении глаз при пемфигоиде до 20% случаев отрицательны в ПИФ (52, 53). Поэтому в некоторых исследованиях серологические анализы с выявлением циркулирующих аутоантител и гистологические исследования включены в диагностические критерии (39, 52, 54, 55). Для уточнения диагноза ПСО мы предлагаем диагностические критерии, основанные на современных данных. Мы подчеркиваем важность серологических анализов, особенно в случаях негативной ПИФ (Рис. 1). 1). Диагноз ПСО подтверждается при наличии клинических критериев и результатов ПИФ. В ПИФ-отрицательных или ПИФ-недоступных (не выполненных) случаях требуется по крайней мере одно серологическое или гистологическое подтверждение.

Данные о механизмах образования пузырей при поражениях полости рта при пемфигоиде

Клинические данные при поражении слизистой оболочки при пемфигоиде

Некоторые данные демонстрируют ассоциации между поражением слизистой оболочки и определенными клиническими особенностями при пемфигоиде. Kridin и соавт. сообщается, что у больных БП с нормальными показателями эозинофилов поражения слизистых встречаются чаще, чем у больных с повышенным уровнем эозинофилов (56). У некоторых пациентов с вовлечением в патологический процесс слизистой полости рта прием ингибитора дипептидилпептидазы-4 (DPP-4i) ассоциирован с началом БП (57). Была также отмечена связь между ПСО и потреблением ДДТ-4i (58). Кроме того, определенный аллель HLA (HLA-DQB1 ^* 03:01) ассоциирован с возникновением ПСО (59–63). HLA-DQB1^*03: 01 также связано с высоким риском DDP-4i-ассоциированного БП (59). Hofmann и соавт. показано, что у 56% больных БП с поражением слизистой оболочки отмечалась реактивность IgG как к COL17-NC16A, так и к C-концевым участкам COL17 (64). Clape и соавт. выявлено, что отсутствие анти-BP230 аутоантител ассоциировано с наличием поражения слизистой оболочки при БП (65).

Экспериментальные данные по ПСО in vivo и in vitro

В дополнение к предыдущим исследованиям механизмов образования пузырей при БП было продемонстрировано несколько доказательств, которые частично объясняют патогенез ПСО.

Ламинин 332-тип ПСО

В 2017 году Heppe и соавт. создали мышиную модель, в которой введенные кроличьи анти-ламинин-332 IgG антитела вызывали развитие субэпидермальных пузырей на коже ушных раковин, глазах и полости рта взрослых мышей C57BL/6 (66). В этой модели клинические проявления являются Fc-рецептор-зависимыми и комплемент-зависимыми, аналогично тем, что и в предыдущих моделях БП у мышей. Между тем, Lazarova и соавт. показано, что инъекции кроличьего анти-ламинина-332 IgG или Fab-фрагментов индуцировали образование субэпидермальных пузырей на коже новорожденных мышей BALB/C (67, 68). В этой мышиной модели переноса антител с дефицитом C5- или тучных клеток также образовывались субэпидермальные пузыри на коже (67). Эта же группа исследователей создала модель трансплантата кожи человека, с использованием мышей SCID (69). Исследователи отметили, что инъекция очищенного IgG, полученных от больных ПСО или анти-ламинина-332 IgG приводила к невоспалительным субэпидермальным пузырям на коже. Эти модели из последней группы могут определять патомеханизмы при ПСО, однако в этих моделях отсутствует преимущественное поражение слизистой оболочки.

COL17-тип ПСО

Несмотря на то, что экспериментальные мышиные модели ПСО для изучения ламинина тип-332, были проведены исследования in vivo ПСО по изучению COL17, которые не давали нужного результата. В предыдущих исследованиях COL17-таргетных мышиных моделей для БП повреждения слизистой полости рта не изучались и отсутствовали описания, как клинически, так и гистологически (70–73).

Для патогенеза COL17-типа ПСО in vitro, Imanishi и соавт. сообщается, что некоторые IgGs при ПСО, нацеленные на C-конец COL17, показали интернализацию COL17 как в кератиноцитах слизистой полости рта, так и в клетках DJM-1 (74), которые являются клетками из клеточной линии плоскоклеточного рака (75). В отличие от этого, другие IgGs при ПСО, вырабатываемые против C-конца не индуцировали интернализацию COL17 полностью. Считается, что аутоантитело-индуцированный эндоцитоз COL17 играет важную роль в образовании пузырей при пемфигоиде (76, 77). Однако остается неясным, почему некоторые IgGs при ПСО, нацеленные на C-конец COL17, показывают интернализацию COL17.

Возможные механизмы образования пузырей в слизистой оболочке полости рта при пемфигоиде

Несмотря на то, что COL17 является основным таргетным антигеном как при БП, так и при ПСО, органы, которые преимущественно поражаются при этих двух заболеваниях различаются. Механизмы образования пузырей при аутоиммунных буллёзных заболеваниях с образованием субэпидермальных пузырей сложны, но они тесно связаны с различными факторами, такими как активация комплемента и образование воспалительных клеточных инфильтратов (78, 79). В противоположность этому, было описано несколько доказательств относительно комплемент-независимого образования пузыря при БП ( 80). Анти-COL17-NC16A антитела индуцируют интернализацию и уменьшение количества COL17 и приводят к недостаточной силе адгезии кератиноцитов (76). Уменьшение количества COL17 имеет важное значение для образования пузырей вдоль lamina lucida без воспаления. Мы заметили, что ни одно исследование не касалось патомеханизмов поражения полости рта как при БП, так и при ПСО. Прежде чем описывать возможные механизмы патогенеза ПСО, мы сначала сосредоточимся на формировании пузырей в слизистой оболочке полости рта при БП.

Механизм образования пузырей в слизистой оболочке полости рта при БП

Недавно мы получили новые данные о механизме образования пузырей при поражении полости рта (81). Мы показали, что экспрессия COL17 примерно на 30-50% выше в кератиноцитах слизистой оболочки, чем в кератиноцитах кожи, что подтверждается qPCR и иммуноблоттинговым анализом. Эта более высокая экспрессия COL17 в кератиноцитах слизистй связана с более сильной адгезией клеток в этих кератиноцитах. Было установлено, что прочность адгезии клеток на 50% выше для кератиноцитов слизистой, чем для кератиноцитов кожи. Кроме того, анти-COL17-NC16A антитела индуцируют значительно более выраженное уменьшение количества COL17 в кератиноцитах кожи, чем в кератиноцитах слизистой оболочки. Это указывает на то, что более высокая экспрессия COL17 в слизистой оболочке может компенсировать уменьшение количества COL17, вызванное пемфигоидными IgG. Другими словами, преобладающее образование пузырей на коже может быть связано с остаточным количеством COL17 после того, как БП-IgG индуцирует уменьшение количества COL17. Это похоже на механизм образования пузырей при пузырчатке, при котором десмоглеин-1 и -3 компенсируют друг друга в слизистой оболочке полости рта и коже. Потенциальное образование пузыря при БП инициируется связыванием аутоантител к COL17, что приводит к интернализации и уменьшению количества COL17 из плазматической мембраны. Уменьшение количества COL17 может ухудшить образование полудесмосом и ослабить прочность адгезии к базальной мембране. Окончательно, потеря связи может быть при механическом воздействии или воспалением, индуцированным через Fc-фрагмент IgG. Более низкая частота поражения полости рта при БП может быть связана с высоким уровнем экспрессии COL17 в слизистой оболочке полости рта (рис. 2а). 2А). Кроме того, мы показали, что IgG, образующегося против C-конца COL17 могут иметь патогенность. Патогенность IgG в отношении областей вне домена NC16A остается спорной как in vivo, так и in vitro (74, 82, 83). В нашем исследовании, уменьшение количества COL17 было значительно усилено стимуляцией с помощью комбинации IgGs против домена NC16A и C-конца (рисунок (Figure2A). 2А). Эти данные показывают, что у пациентов с БП IgG нацелены не только на домен NC16А, но также и на С-конец и могут вызывать образование пузырей на коже и слизистой оболочке. В подтверждение этого в нескольких исследованиях была продемонстрирована ассоциация между аутоантителами к С-концу и поражением слизистой оболочки при БП (64, 84). Аутоантитела, нацеленные на C-конец, потенциально патогенны в некоторых случаях БП.

ПСО-специфический механизм образования пузырей без воспаления

Гистологически пациенты с ПСО имеют менее выраженные воспалительные проявления, чем пациенты с БП. Механизм образования пузырей при ПСО может отличаться от механизма образования пузырей при БП. Недавно мы обнаружили прямую связь между коллагеном IV (COL4) и COL17 в кератиноцитах кожи и полости рта (24). Интересно, что это связывание COL4-COL17 нарушается при выработке IgG против C-конца в кератиноцитах слизистой полости рта. Кроме того, было обнаружено, что несколько ПСО-IgG, нацеленных на C–конец COL17, ингибируют связывание COL4-COL17 и приводят к снижению полудесмосомной адгезии (рис. 2b). 2B). То есть, ПСО-IgGs может непосредственно нарушить связывание COL4-COL17 и привести к расщеплению ЗБМ без воспаления.

Что касается возможного механизма образования пузырей при ПСО типа ламинин-332, Fc-зависимые и комплемент-зависимые механизмы были выявлены с помощью мышиной модели типа ламинин-332. Однако ламинин-332 взаимодействует с другими молекулами ЗБМ, включая COL17. Учитывая нашу последнюю концепцию образования ПСО-специфичных пузырей, антитела против ламинина-332 могут нарушать молекулярные взаимодействия ламинина-332, что приводит к преобладанию образования пузырей на слизистой при ламинин-332-типе ПСО.

Вывод

Как было подчеркнуто в настоящем обзоре, мы предлагаем диагностические стратегии для ПСО, специфичные для конкретного заболевания. Патогенез COL17-типа ПСО отличается от патогенеза БП и более тесно связан с невоспалительными механизмами образования пузыря вследствие ингибирования связывания COL4-COL17 или уменьшения количества COL17.

Этические аспекты

Исследования проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией и были одобрены комитетом по этике Хоккайдского университета.

Вклад авторов

Все перечисленные авторы внесли существенный непосредственный интеллектуальный вклад в работу, а также одобрили ее к публикации.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть расценены как потенциальный конфликт интересов.

Глоссарий

Сокращения