Современные требования к диагностике генитальной папиллома-вирусной инфекции: количественный подход

Куевда Д.А., Шипулина О.Ю., Минкина Г.Н., Пиксасова О.

ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, МГМСУ, г. Москва, ООО «ИнтерЛабСервис»

Цель: разработка методики количественного определения широкого спектра генотипов ВПЧ высокого онкогенного риска (12 типов) и оценка ее клинических характеристик в условиях скрининга.

Материалы и методы: в качестве метода для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ использовалась полиме-разная цепная реакция в реальном времени. В разработанной для этих целей тест-системе «Амплисенс ВПЧ ВКР Скрин-Титр FRT» используется принцип амплификации с выщеплением 5’-концевой метки специфического зонда (TaqMan Assay) и принцип группоспецифических олигонуклеотидов, способных амплифицировать фрагменты ДНК нескольких представителей филогене-тической группы. Количественное определение основано на использовании стандартных образцов с известной концентрацией ДНК ВПЧ и ДНК человека. Результат рассчитывается в геномных эквивалентах вируса (г.э.) нормализованных на 10^5 геномов человека. Нормализация на количество геномов позволяет нивелировать эффект вариаций забора клинического материала. Порог релевантного количества вируса принимался равным 10^3 г.э. на 10^5 геномов человека, что примерно соответствует (при использовании предложенного нами метода забора образцов (цервикальный цитологический зонд помещается в 600 мкл транспортной среды и сохраняется до доставки в лабораторию), метода экстракции ДНК (ДНК-Сорб-АМ и ДНК-Сорб-Д, ФГУН ЦНИИЭ) порогу в 1 пг/мл ДНК ВПЧ, описанному Snijders и Lorincz. Оценка возможностей количественной оценки проведена на 99 образцах, охарактеризованных методом жидкостной цитологии и гистологии как H-SIL или РШМ и 305 образцах, охаракте-ризованных как норма или реактивные изменения.

Результаты: в ходе исследования при помощи разработанной методики образцов H-SIL и РШМ ДНК ВПЧ выявлена в 99,0% случаев (98 из 99), при введении количественного порога 10^3 г.э. ВПЧ (3lg) на 10^5 геномов — в 98,0% (97 из 99). В одном образце вирусная нагрузка составила 2,9 lg, что оказалось на 0,1 ниже порогового значения. При попытке повысить пороговое значение до 10^4 г.э. ВПЧ (4lg) на 10^5 геномов количество выявленных случаев H-SIL составило 84,8% (84 из 99). Таким обра-зом, в случае тяжелой дисплазии и рака вирусная нагрузка практически никогда не оказывается ниже порога 10^3 г.э. ВПЧ (3lg) на 10^5 геномов, при этом попытка повысить данный порог приводит к потере чувствительности. При исследовании образцов нормы или реактивных изменений ДНК ВПЧ выявлена в 36,8% образцов (112 из 305) (специфичность 63,2%). Введение порога клинической значимости на уровне 10^3 г.э. ВПЧ (3lg) на 10^5 геномов позволило отсечь 51% ВПЧ положительных образцов с диагнозом норма или реактивные (57 из 112) как содержащих незначимое количество вируса. Таким образом, при использо-вании порога клинической значимости ДНК ВПЧ в образцах нормы или с реактивными изменениями выявляется в 18,1% (55 из 305) (специфичность 81,9%).

Выводы: разработана методика количественного определения 12 генотипов ДНК ВПЧ на основе ПЦР в режиме реаль-ного времени и показано, что введение порога клинически значимого количества вируса на уровне 10^3 г.э. на 10^5 геномов человека позволяет повысить специфичность исследования с 63,2% до 81,9% при сохранении чувствительности на высоком уровне – 98%. Таким образом, введение порога вирусной нагрузки может быть рекомендовано для проведения более специ-фичного скрининга.