ДЕЙСТВИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ПРОЦЕСС ФОРМИРОВАНИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК Летяева О. И., Гизингер О. А. НИИ иммунологии ЧелГМА, Консультативно­диагностический центр ЧелГМА, Челябинск ВВЕДЕНИЕ. Нейтрофилы рассматриваются как основные клетки, играющие ведущую роль в противоинфекционной защите организма, высвобождая широкий спектр противомик­робных компонентов. Нейтрофилы являются первой линией защиты иммунной системы организма от патогенных микроорганизмов, перемещаясь по направлению к очагам инфици­рования и воспаления. В 2004 г. Arturo Zychlinsky открыл механизм уничтожения патогенов нейтрофилами, который заключается в способности активированных клеток «выбрасывать» сетевидные образования, в которых задерживаются, нейтрализуются, а затем и погибают микроорганизмы. Эти новые структуры получили название нейтрофильных экстрацеллюляр­ных ловушек (NET — Neutrophil Extracellular Traps). Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) представляют собой очень тонкие нити. Взаимодействие с бактериями активизиру­ет нейтрофил, при этом изменяется структура ядра клетки и содержащихся в нем гранул. Попав во внеклеточное пространство, содержимое клетки формирует своеобразную сеть, в которую и попадают бактерии. НВЛ эффективны в борьбе с патогенными и условно па­тогенными микроорганизмами. Количество погибающих в сетях бактерий сопоставимо с количеством микроорганизмов, уничтожаемых нейтрофилом при жизни. Эксперимен­тальные и клинические исследования влияния лазера низкой интенсивности (НИЛИ) сви­детельствуют об изменении энергетической активности и конформационного состояния мембран клетки, перестройке ядерного аппарата, активации основных ферментных систем, окислительно­восстановительных процессов в нейтрофиле, увеличении продукции мак­роэргических соединений. Исследования по изучению функциональной активности ней­трофильных гранулоцитов в крови и биологических секретах показали, что при облучении нейтрофилов, выделенных из периферической крови человека, наблюдается повышение их фагоцитарной и секреторной активности, при этом происходит активизация процессов как по кислородзависимому, так и по кислороднезависимому пути. Усиление секреторной активности нейтрофильных гранулоцитов приводит к увеличению содержания лизосомаль­ных и катионных белков в клетках. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ — изучение воздействия низкоинтенсивного лазерного излуче­ния на процесс формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек в крови человека. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. Объектом исследования были нейтрофильные гранулоциты, выделенные из периферической венозной крови здоровых доноров. Гепаринизирован­ную венозную кровь (25 ЕД на 1 мл крови) смешивали с раствором натрия хлорида 0,9% в равных объемах. Затем выделяли нейтрофилы на градиенте двойной плотности фиколла­верографина (плотность = 1,077 и 1,093 г / см), клетки осаждали центрифугированием в течение 45 минут при 1500 об/мин, далее дважды отмывали раствором натрия хлорида 0,9%. Выход нейтрофилов составлял 90 – 95%. Нейтрофильную взвесь доводили до объ­ема 1 мл и стандартизировали до концентрации 5 ´ 106/ мл путем подсчета количества клеток под световым микроскопом в камере Горяева. Нейтрофильные лейкоциты облучали лазером низкой интенсивности в силиконизированных пластмассовых одноразовых чашках Петри диаметром 40 мм в количестве 1 мл. Лейкоциты облучали сверху в течение 4 минут He­Ne­лазером («Урал­И»). Применялся непрерывный режим излучения, длинна волны 632 нм, частота излучения лазера 80 Гц, мощность лазера 50 Вт. Облучение производили в светоизолированной камере при температуре 36,6 °С. Контрольные пробы подвергали темновой инкубации при аналогичных условиях без облучения He­Ne­лазером. Нейтро­фильную взвесь наносили на предметное стекло, фиксировали 96%­ным этиловым спиртом и окрашивали раствором красителя акридинового оранжевого. Результаты оценивались при помощи люминесцентной микроскопии. В мазках подсчитывалось процентное содержа­ние нейтрофилов с сегментированным ядром, нейтрофилов с недифференцированным яд­ром и нейтрофильных внеклеточных ловушек. Обработка материала производилась методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ Statistic for Windows. РЕЗУЛЬТАТЫ. Для выявления влияния НИЛИ на процесс формирования НВЛ у нейтро­фильных лейкоцитов была сформирована экспериментальная группа, в которую вошли 36 человека в возрасте от 18 до 35 лет (средний возраст 25,4 ± 0,3 года). При облучении нейтрофильных гранулоцитов НИЛИ с переменной генерацией импульса (длина волны 632 нм, частота 80 Гц, мощность 50 Вт) в течение 4 минут формируется 22% нейтрофиль­ных внеклеточных ловушек от общего числа нейтрофилов, в интактных нейтрофилах доля НВЛ составила 7%. Также отмечалось увеличение числа нейтрофилов с недифференци­рованным ядром во взвеси нейтрофильных гранулоцитов, обработанных лазером, — 13% по сравнению с контролем — 23%. Инкубация нейтрофильных гранулоцитов в тер­мостате 30 минут при температуре 36,6 °С с последующим их облучением НИЛИ в течение 4 минут приводит к образованию нейтрофильных внеклеточных ловушек в количестве 28%, во фракции нейтрофилов, подвергшихся лишь температурной обработке (инкубация в тер­мостате 30 минут при 36,6 °С), количество НВЛ составило 11%. Также наблюдалось ста­тистически значимое отличие в двух группах (НГ, подвергшиеся температурной обработке в термостате 30 минут при температуре 36,6 °С, и НГ, подвергшиеся как температурному фактору, так и лазерному ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Облучение нейтрофильных гранулоцитов НИЛИ с переменной генерацией импульса приводит к увеличению количества нейтрофильных внеклеточных ловушек. Сов­местное действие НИЛИ и температуры вызывает увеличение количества НВЛ по сравне­нию с нейтрофильными гранулоцитами, на которые воздействовал только температурный фактор.