Прямую микроскопию легко выполнить в клинике, и она предоставляет ценную информацию для лечения кожных инфекций и инвазий.

Введение

Прямая микроскопия является ценным навыком в лечении диагностике инфекций и инвазий, однако она недостаточно используется в дерматологических клиниках. Сама процедура не является ни сложной, ни требующей много времени; однако для правильной интерпретации полученных результатов требуется практика. В этой статье обсуждается роль микроскопии на примерах распространенных грибковых инфекций кожи и чесотки. Представлен практический подход к прямому микроскопическому исследованию клинического материала, начиная со сбора и обработки образцов для микроскопии и заканчивая интерпретацией результата.

Грибковые инфекции

Грибы — это эукариотические организмы, способные существовать как в форме плесени, так и дрожжей. Плесневые грибы многоклеточны, состоят из нитевидных гиф и размножаются спорообразованием, тогда как дрожжи преимущественно одноклеточны и размножаются почкованием. Некоторые грибы диморфны, обладая способностью переключаться между дрожжевой и гифозной формами роста.

Поверхностные микозы в совокупности являются одними из наиболее распространенных заболеваний, поражающих людей [1]. Эти грибковые инфекции ограничиваются кожей (преимущественно роговым слоем), поверхностями слизистых оболочек и придатками кожи; подробная информация приведена в таблице 1.

Таблица 1. Поверхностные микозы.

Первый шаг в исследовании поверхностной грибковой инфекции включает обнаружение организма в тканях. Это может быть выполнено в дерматологической клинике путем прямого микроскопического исследования кератина из образцов кожи, волос или ногтей.

Один и тот же подход к сбору клинического материала может быть использован для всех пациентов. Образцы можно собирать непосредственно на предметное стекло или в сложенный картонный конверт [стандартные наборы для упаковки материала включают MycoTrans (Mycotrans Ltd, Биггар, Ланкашир, Великобритания) и Dermapak (Dermaco Ltd, Тоддингтон, Бедфордшир, Великобритания)], что удобно для работы с образцом, а также для хранения и транспортировки в течение длительного времени и дальнейшей обработки.

Хорошей практикой во всех случаях является взятие большого количества образцов, чтобы убедиться в наличии достаточного количества материала для микроскопии и культивирования.

Взятие образца для исследования

Поражения кожи следует соскабливать с помощью скальпеля, предпочтительно тупым краем. Обширные поражения кожи следует соскабливать с края, поскольку именно в этой области с наибольшей вероятностью могут содержаться жизнеспособные организмы.

При наличии пузырьков или пустул можно взять образец покрышки пузыря, поскольку она часто содержит обильные гифы. Хотя ключом к диагностике стригущего лишая является выявление инвазии волосяного стержня, образцы кожи головы лучше всего получать путем соскоба кожи; чешуйки часто содержат инфицированные пеньки волос, которые клинически не видны. В идеале волосы должны быть удалены с неповрежденным корнем. Волосы можно выщипывать щипцами, и инфицированные волоски часто легко выдергиваются.

Расчески для волос полезны при инфекциях кожи головы для получения материала для посева и могут лучше переноситься маленькими детьми; однако для целей микроскопии полученный образец уступает соскобу с кожи и во многих случаях не дает достаточного количества материала.

Получить образцы ногтей может быть сложнее. В случаях поверхностного белого онихомикоза (SWO) соскоб с поверхности ногтя может обеспечить достаточный для исследования образец; однако во всех остальных случаях следует брать образец по всей толщине ногтя путем срезания. Клинически изменённый ноготь следует обрезать как можно дальше проксимально, не причиняя дискомфорта пациенту.

Материал с околоногтевых валиков может стать ценным материалом для микроскопии, в том числе в случаях паронихии, и его следует осторожно удалять и добавлять к образцу. Это может быть выполнено с помощью скальпеля (рис. 1), хотя в равной степени подходящими инструментами являются зубной зонд, диатермический зонд или небольшая кюретка.

В полости рта с поверхности слизистой оболочки можно взять образец с помощью тампона или осторожно соскоблить тупым зондом или кюреткой. Такой же подход может быть использован при диагностике очагов на слизистых оболочках гениталий, хотя у пациентов мужского пола может быть проще получить мазок с поверхности, прижав предметное стекло непосредственно к пораженной ней.

Мазки полезны для взятия проб с поражений кожи с минимальным количеством чешуек (если при соскабливании получается недостаточно материала) и могут лучше переноситься при поражении волосистой части головы у детей. Альтернативный метод включает в себя использование кусочка липкой ленты для удаления с поверхности кожи и нанесение ее непосредственно на предметное стекло микроскопа.

Подготовка образца

Все образцы должны подвергнуться обработке, что обычно достигается путем помещения образца в 10-30%-ный раствор гидроксида калия (KOH) на предметном стекле микроскопа (рис. 2). Это размягчает ткань, позволяя образоваться тонкому слою клеток, что значительно облегчает просмотр грибковых структур. Более высокие концентрации КОН растворят образец за небольшое время, но также могут привести к образованию кристаллов, что может стать бесполезным артефактом при микроскопическом исследовании.

Инкубация образца при более высоких температурах, обычно между 37°C и 45°C, или нагревание на огне также сократит время, необходимое для размягчения ткани, хотя в условиях клиники это может оказаться неосуществимым. Любой образец, даже толстый ноготь, если поместить в 30%-ный раствор КОН и нагреть, может быть достаточно размягчен менее чем за 1 час.

Как только образец размягчится, предметное стекло следует поместить на плоскую поверхность и сильно надавить на покровное стекло, чтобы добиться равномерного распределения образца по предметному стеклу. Исключением из этого правила являются образцы волос, с которыми необходимо обращаться осторожно, а не сдавливать.

Это необходимо для сохранения структуры волос и позволяет провести полную оценку инфекции и распространения артроконидий. Образцы волос, оставленные на длительное время, могут расщепиться и разрушиться, что сделает невозможным дифференциации эктотриксного и эндотриксного расположения спор; поэтому их следует исследовать как можно скорее. КОН может повредить линзу микроскопа, поэтому любые излишки следует удалить с предметного стекла, промокнув их бумагой.

Интерпретация результата

В условиях дерматологической клиники, скорее всего, препараты будут исследоваться при ярком освещении с использованием составного светового микроскопа; это, безусловно, самый простой подход. Использование флуоресцентной микроскопии с окрашиванием, таким как кальцифтористый белый, значительно облегчает обнаружение и визуализацию структуры грибковых элементов; однако для этого требуется флуоресцентный микроскоп или дополнительное оборудование, и то, и другое является дорогостоящим.

Первоначально образец следует исследовать при малом увеличении (× 10) и относительно слабом освещении, систематически просматривая весь образец. При обнаружении грибковых элементов яркость можно увеличить, а увеличение повысить до × 20 или × 40 для получения лучшего изображения.

Все дерматофиты морфологически неразличимы в тканях; однако наличие гиф подтверждает грибковую инфекцию (рис. 3а). Гифы дерматофитов обычно узкие и однородные по ширине, с тонкой клеточной стенкой и правильными септами (делениями между клетками гриба). Разветвление гиф может происходить без септ или сужения в месте разветвления. Могут наблюдаться артроконидии (круглые споры), как по отдельности, так и в виде цепочек различного размера.

Дерматофитные гифы, полученные из образцов ногтей, могут иметь неправильный внешний вид с изменением ширины гиф их вида; однако значительная степень фрондинга должна побудить к рассмотрению варианта обнаружения недерматофитной плесени. Фрондинг относится к пальмовидным разветвлениям на концах гиф; по этой причине его также называют ‘терминальным фрондингом’. Инфекция волос, вызываемая дерматофитами, протекает по четким этапам, которые можно распознать по расположению конидий и/или гиф по отношению к волосам.

Основное различие заключается в поражении по типу “endothrix”, при котором артроконидии содержатся внутри стержня волоса (рис. 3b), и “ectothrix”, при котором наблюдается рост артроконидий снаружи стержня волоса (рис. 3c).

Ectothrix далее подразделяется на ectothrix с мелкими спорами (SSE) со спорами диаметром 2-3 мкм и ectothrix с крупными спорами диаметром 5-8 мкм; однако это различие может быть минимальным и его трудно оценить. Всегда следует проводить посев; однако характер инвазии волос, наблюдаемый при микроскопии, позволяет быстро определить вероятного возбудителя.

Эндотелиальная инфекция вызывается антропофильными видами трихофитонов, такими как Trichophyton tonsurans и Trichophyton violaceum, которые хорошо реагируют на тербинафин. Напротив, SSE вызывается видами Microsporum, включая Microsporum audouinii (антропофильный) и Microsporum canis (зоофильный), для лечения которых тербинафин менее эффективен, и предпочтительными методами лечения были бы гризеофульвин или итраконазол.

Candida albicans — это полиморфные дрожжи, способные формировать почкующиеся клетки, а также нити, которые могут быть истинными гифами или псевдогифами (удлиненными дрожжами). Виды Candida могут быть выделены из здоровой кожи, поэтому корреляция с микроскопией и клиническими данными жизненно важна, если данные получены с помощью культурального исследования. Обнаружение типичных почкующихся дрожжей с нитями в материале с кожи, обработанном KOH, подтверждает инфекцию (рис. 4а). При C. Non-albicans-инфекциях часто можно увидеть дрожжевые клетки без гиф.

Дрожжи Malassezia ответственны за распространенное заболевание - отрубевидный лишай. Культивирование организма бесполезно, так как дрожжи Malassezia часто составляют часть нормальной кожной флоры. Прямая микроскопия кожи подтверждает диагноз, если обнаруживаются короткие фрагменты широких гиф вместе с крупными сферическими дрожжами (рис. 4б). Именно наличие гиф подтверждает патогенное значение организма при этом заболевании, в отличие от изолированных форм дрожжей, которые могут быть обнаружены на нормальной коже, хотя редко можно наблюдать инфекции, проявляющиеся только овальными формами дрожжей. Малассезия фолликулит — это особое заболевание, часто характеризующееся обилием дрожжевых форм внутри волосяных фолликулов. Гифозные формы наблюдаются редко, и диагноз ставится путем наблюдения типичных клинических проявлений в сочетании с дрожжевыми формами при прямой микроскопии [2].

Часть инфекций кожи и ногтей, наблюдаемых в Великобритании, вызвана недерматофитными плесневыми грибами. Инфекция Neoscytalidium dimidiatum и Neoscytalidium hyalinum распространена в тропиках и может наблюдаться в Великобритании у пациентов, мигрировавших из эндемичных стран. Инфекция может вызвать дистрофию ногтей с темным обесцвечиванием и поражением кожи ладонно‐подошвенной области, имитирующую сухую форму поражения T. rubrum.

В препаратах, обработанных KOH кожи или ногтей, могут быть обнаружены гифы неравномерной ширины; однако они часто напоминают гифы дерматофитов. Гифы N. dimidiatum могут быть пигментированы in situ. Это состояние свидетельствует о плохой реакции на все противогрибковые препараты. Скопуляриопсис вызывает инфекцию ногтей, в результате чего ноготь становится коричневым и крошится. При приготовлении KOH могут обнаружиться характерные конидии в форме лимона. Другие недерматофитные гифозные организмы, вызывающие инфекцию ногтей, включают виды Aspergillus, Fusarium и Acremonium. На наличие этих микроорганизмов может указывать клиническая картина SWO и/или наблюдение при непосредственном осмотре неправильных гиф с обширным разветвлением и фрондингом.

Чесотка

Чесотка представляет собой проблему для общественного здравоохранения во всем мире, в том числе в странах с высоким уровнем дохода, в результате вспышек в больницах и других учреждениях [3]. Клиническая диагностика может быть сложной задачей, особенно у пожилых людей [4].

В случаях, когда это возможно, всегда следует пытаться непосредственно визуализировать клеща с помощью микроскопии. Соскобы лучше всего брать из области ходов, если они видны, и дерматоскопия может помочь в этом. Образцы могут быть обработаны KOH и исследованы с использованием уже описанного подхода. Чесоточных клещей можно легко увидеть при малом увеличении (рис. 5а) наряду с другими структурами, включая яйца и сцибалы (фекалии), а более детальные изображения можно получить при большом увеличении (рис. 5б).

Возможность быстро подтвердить диагноз и сообщить особенно полезна в случаях корковой чесотки в больницах или специализированных учреждениях, чтобы предотвратить или ограничить распространение вспышки. При дальнейшем приобретении опыта аналогичный подход может быть применен для выявления других важных с медицинской точки зрения эктопаразитов.

Выводы

Прямое микроскопическое исследование тканей, описанное в этой статье, является полезным практическим навыком в дерматологии. Процесс сбора клинического образца прост и неинвазивен. Затем образцы могут быть быстро обработаны и исследованы в клинике, и при правильной технике результат может быть получен за считанные минуты. Это представляет собой золотой стандарт в лечении чесотки, обеспечивая подтверждение диагноза и позволяя начать лечение.

В контексте поверхностных микозов прямая микроскопия предоставляет важную информацию об инфекции, которую не могут выявить другие методы. Наличие гифозных форм Candida и Malassezia, например, может подтвердить активную инфекцию, а не колонизацию, что является информацией, которую невозможно получить культуральными или молекулярными методами.

Прямая микроскопия может позволить клиницисту принять предварительное решение о лечении в клинике, ожидая результатов дальнейших исследований, как в случае со стригущим лишаем.

Использование микроскопии таким образом может дать хороший результат, и при надлежащем наблюдении и доступе к микроскопу эти навыки могут быть быстро приобретены. Хотя это выходит за рамки данной статьи, прямая микроскопия также играет важную роль в быстрой диагностике других грибковых инфекций, включая мукормикоз и эндемические подкожные микозы, такие как мицетома и хромобластомикоз.