В Сан-Диего на ежегодной конференции, посвященной проблеме онкологических заболеваний кожи, экспертным мнением о молекулярно-генетических методах диагностики меланомы поделился д-р G.A. Hosler, профессор патоморфологии и дерматологии Техасского юго-западного медицинского центра в Далласе.
В своем выступлении д-р G.A. Hosler уделил пристальное внимание четырем методикам, применяемым не только для диагностики и классификации меланом, но и для выявления повышенного риска развития меланомы у пациентов, а также для определения наилучшей тактики лечения.
«У каждого метода есть свои преимущества и недостатки», – резонно заметил спикер.
Начал обсуждение генетических методов диагностики меланомы д-р G.A. Hosler со сравнительной геномной гибридизации (Comparative genomic hybridization, CGH). Эта техника позволяет выявить количество копий измененных участков хромосом в геноме опухолевых клеток.
«При проведении CGH-теста, ДНК опухоли и нормальная ДНК маркируются отдельно, затем каждый образец сравнивают с референсными показателями из «геномной библиотеки». Таким образом можно выявить «добавочные» или «выпавшие» участки генов в опухолевых клетках», – пояснил д-р G.A. Hosler. – «Раньше такая «геномная библиотека» представляла собой хромосомы в метафазе митоза – выявление и подсчет «несовпадающих» участков генома представляли значительные технические сложности, весь процесс занимал много времени. И сегодня метод сравнительной геномной гибридизации обычно используется в исследовательских целях – его не выполняют рутинно в клинических лабораториях».
Более современная версия CGH – анализ однонуклеотидных полиморфизмов с помощью ДНК-микрочипа (SNP array).
«Интересно, что такие микрочипы можно как приобрести, так и самостоятельно спроектировать. На чип можно записать весь геном, или определенные интересующие участки, но в лучшем «разрешении». Преимущество метода SNP array в том, что за один «сеанс», за одну реакцию можно определить все потери и вставки хромосомного материала. Артефакты, связанные со случайной потерей нужных участков материала, как это нередко наблюдается при FISH-тестах, редки; метод позволяет выявить утрату гетерозиготности, результат более информативен, удобен для ранжирования и клинического применения», – оценил д-р G.A. Hosler. – «Впрочем, есть у SNP array и недостатки: например, эта техника не позволяет анализировать избранный специфический тип клеток. То есть, если опухоль гетерогенна по своей клеточной структуре, метод не способен это определить, на основании микрочипа проводится анализ всех разнородных клеток, которые есть в образце. Невозможно «выделить» нужные участки новообразования для анализа. Также SNP array не учитывает сбалансированные транслокации хромосом. Помимо прочего, метод дорогостоящий, а тест-системы разрабатываются в лабораториях, и в каждой лаборатории техника изготовления микрочипов своя. Для применения этой методики нужно специальное оборудование, а для интерпретации результатов – специально обученный эксперт».
Вышеупомянутая FISH-реакция (флуоресцентная in situ гибридизация) в первоначальном своем виде стала доступна в 2009 году и характеризовалась показателями чувствительности в 87%, специфичности – около 95%. Для FISH-тестов первого поколения использовались 6 проб и 4 красителя, однако у метода сразу обнаружились значительные недостатки – в частности, проблемы возникали с диагностикой невусов Спитц. В невусе Спитц нередко происходит удвоение хромосомного набора – клетки новообразования не диплоидны, а тетраплоидны.
Во втором поколении FISH-тестов проблему решили с помощью добавления центромер – таким образом, избранные пробы можно сравнивать с центромерами «такой же» хромосомы и определять, произошло ли «задваивание» хромосомного материала из-за генетической поломки или образовались копии целых хромосом. Эта модификация позволила повысить чувствительность и специфичность метода до 94% и 98% соответственно.
«FISH-реакции широко применяются в клинической практике, для крупных клинических лабораторий это рутинный метод диагностики. Его главное преимущество в том, что FISH позволяет анализировать специфический тип клеток, это полезно для диагностики маленьких или гетерогенных по структуре опухолей. В некоторых случаях FISH-тесты [в США] покрываются страховкой, результат, получаемый с помощью этого метода, имеет высокую диагностическую и прогностическую ценность. Так, известно, что в меланоцитарных опухолях изменение числа копий генов CDKN2A, CCND1, MYC, топоизомеразы и BAP1 сопряжено с худшим клиническим прогнозом для пациента», – рассказал коллегам д-р G.A. Hosler.
К недостаткам метода эксперт отнес его дороговизну, трудоемкость и необходимость привлечения отдельного специалиста для оценки результатов реакции.
«Интерпретация результатов – непростой процесс, варианты окрашивания нельзя оценить одновременно, оценка результатов одной и той же FISH-реакции может различаться от лаборатории к лаборатории. FISH-тесты не одобрены FDA (Управление по санитарному надзору в США)».
Методы секвенирования нового поколения (Next generation sequencing, NGS), по мнению д-ра G.A. Hosler, это «действительно диагностические методики будущего». Подобные тесты позволяют секвенировать весь геном, или несколько раз максимально тщательно изучить избранный участок генетической последовательности: «это полезно, если необходимо обнаружить низкочастотные мутации».
Методы NGS позволяют выявить точечные изменения в генах BRAF и KIT, мутации в доброкачественных и доброкачественных меланоцитарных новообразованиях, включая «сложные» для диагностики невусы Спитц и различные десмопластические опухоли.
«Техники секвенирования нового поколения очень разнообразны – можно секвенировать весь геном, весь экзом, транскриптом или отдельную генетическую панель. В панели может быть 10 генов, а может – 1500. Сложность представляет главным образом интерпретация результатов – с таким количеством информации необходимо разобраться в том, что важно, а что неважно для диагноза и прогноза в данном клиническом случае; порой для оценки результатов NGS требуется целая группа специалистов в области биоинформатики».
Еще один недостаток методов нового поколения, как сообщил д-р G.A. Hosler, это необходимость долго ждать результатов – порой ожидание занимает месяцы, что в случае меланомы неоправданно по мнению большинства клиницистов. В США диагностические методы NGS не оплачиваются страховкой, а цены на проведение генетического анализа NGS каждая лаборатория устанавливает самостоятельно.